Các phương pháp tái tạo 1 điện cực với kích thước rất nhỏ so với tế bào sao cho việc gài điện cực không làm phá hủy tế bào

Khi muốn nghiên cứu hoạt động điện của một tế bào đơn, cần thiết phải tái tạo một điện cực với kích thước rất nhỏ so với tế bào sao cho việc gài điện cực không làm phá huỷ tế bào. Để thực hiện mục đích dó, người ta dùng hai loại điện cực, một loại bằng kim loại, còn loại kia là một ống thuỷ tinh cực nhỏ (micropipet), đổ đầy chất điện phân có đầu nhỏ rỗng, mảnh. Các điện cực kim loại được sản xuất bằng nhiều cách mài sắc bằng cơ khí, mài sắc bằng điện phân, (làm nhọn bằng điện), kéo bằng nhiệt, lắng đọng điện, lắng đọng bằng bột hơi và sử dụng kỹ thuật mạch tổ hợp (IC). Tất cả các phương pháp trên sẽ được mô tả song song với các tính chất điện của kim loại và các vi điện cực ống.

  1. Làm nhọn bằng phương pháp cơ học

Do kích thước đỉnh mong muốn rất nhỏ, nên về mặt cơ khí làm nhọn đỉnh(đầu) các thanh hoặc dây kim loại là rất khó khăn. tuy nhiên, Greendfest và Campbell (1942) đã miêu tả một phương pháp mài các kim loại để tạo các điểm 5-10 μm. các kim được gá vào một mâm cặp xoay, đầu (đỉnh) được lμm nhọn bằng một bánh xe mài chống quay tốc độ cao. Nó cho phép đạt được tốc độ cắt cao, cho dù đường kính đầu đỉnh rất nhỏ.

  1. . Làm nhọn bằng điện

Trong nhiều trường hợp có thể làm nhọn đầu cuối của một dây kim loại bằng cách tẩy vật liệu bằng phương pháp điện phân. kỹ thuật này do Greendfest và những người cộng sự đưa ra (1950). Họ đã dùng phương pháp này để chế tạo các điện cực bằng thép không rỉ có đầu mút 1μm. Đầu cuối của một dây thép(đ†ờng kính 0,2mm, độ cứng 18-8) được đặt vào một bình axit gần 34cc axitsunpuric đậm đặc, 42cc axit ortho- phôtphoric và 24cc nước lọc tinh khiết với tỉsố dung dịch 100cc. Một phần của dung dịch này được đặt vào một chén kim loại nhỏ được nối với đầu cuối của một nguồn một chiều 6V. dây dẫn cần làm nhọn được dùng làm anôt. mạch điện còn có một công tắc, một biến trở và một miliampe kế. Một kính hiển vi có độ phóng đại không lớn được lắp ở mặt trướccủa cốc sao cho có thể quan sát được giai đoạn “làm nhọn bằng điện” ở bất kỳ thời gian nào bằng cách đưa các kim ra ngoài dung dịch.Trước hết, người ta dùng dòng điện 30 mA để hình thành hình búp măng cho kim. ở giai đoạn này, đầu cuối của dây dẫn được rút ra chậm để quá trình axithóa có thể bảo đảm tạo hình búp măng và đường kính mong muốn của đỉnh chóp.Tuân theo quá trình làm nhọn này, các tác giả khuyên nên nhúng đầu chóp vào axit Clohidric sau đó rửa và cẩn thận lμm khô và tạo cho đỉnh chóp lớp phủ chấtcách điện. Hubel (1957) cũng đã miêu tả việc dùng kỹ thuật điện phân để làm nhọn, dây tungsten. ông đã tạo ra các kim có đường kính đỉnh chóp từ 0.5 đến0,05 μm. bắt đầu lμm nhọn với dây tungsten (đường kính 0,125mm), ông thấy rằng độ nghiêng của đầu búp măng có thể khống chế bằng cách đưa lên hoặc hạ thấp dây dẫn trong tất cả giai đoạn cuối quá trình sản xuất sau khi kết thúc quá trình làm nhọn bằng điện phân, bổ sung thêm bước đánh bóng. Trong quá trìnhđánh bóng, người ta nhúng một vài milimét đầu cuối vào dung dịch nitrat Kali(KNO3) và cho dòng điện xoay chiều nguồn 2- 6V chạy qua giữa dây dẫn và que than. Điện áp tối ưu không phải là điện áp tới hạn, những dòng điện quá thấp hoặc quá cao sẽ có xu hướng tạo ra hiện tượng rỗ.
Một phương pháp tự động sử dụng kỹ thuật làm nhọn bằng điên để tạo ra một loạt 20 điên cực thép không rỉ và tungsen có đầu nhọn đường kính từ 1 đến 10 pm đã được mills miêu tả (1962). Sự khác nhau trong kỹ thuật sản xuất cho hai kim loại này là loại dung dịch dùng để khắc axit.
Phương pháp của mills là dùng 20 thanh kim loại cần làm nhọn dài (11/2 – 2inch) gá trên một dây kim loại quay ở tốc độ 5 vòng một phút. Khi tay cán quay các điên cực được nhúng hoặc lấy ra khỏi dung dịch làm nhọn bằng điên có thành phần axit sunphoric, axit phốt phoric và nước bằng nhau khi dùng cho các kim loại thép không rỉ, và có thành phần hydroxit soda 0,5M dùng cho dây tungsen (đường kính 0,010 inch). tay quay được nối với cực dương của pin 3V còn đầu cuối cực âm nối với điên cực platini 2cm2. Điên cực này được gá vào một phía của bình điên phân có chứa 500ml dung dịch. Cho dòng điên 200 mlA chạy qua dung dịch chứa điên cực. Mills bắt đầu thực hiên từ thép không rỉ có đường kính đầu mút 30-50 pm. Sau khoảng 6 giờ làm nhọn bằng điên với một chiều quay được giữ qua từng nửa giờ một 85% điên cực có đường kính đầu đỉnh nằm giữa 1 và 6pm. Các điên cực này sau khi rửa, làm khô, mạ cách điên đã có thể sẵn sàng dùng để ghi tần số. Sau khi mạ cách điên, điên cực được làm khô bằng không khí, lớp cách điên được làm cứng bằng cách nung trong một lò ở nhiêt độ 1500C trong 30 phút.
Viêc dùng dòng xoay chiều để làm nhọn bằng điên là do Wollartht và các cộng sự phát minh (1960). Các nhà nghiên cứu này đã để đầu của một dây Platini- Iridi (70%-30%) có độ dài 8-10 mm trong dung dịch Natri Xyanua 50% và Natri Hidroxit 30% được bổ sung để đề phòng hình thành Hydro xyanua. Dòng điên xoay chiều (60Hz) được cho đi qua giữa dây cần làm nhọn và điên cực cacbon nằm trong dung dịch. Đầu búp măng được hình thành do viêc nối nguồn 6-10V và trong khi dòng đi qua, dung dịch được khuấy lên và dây được rút ra từ từ. Đầu nhọn đo được khoảng 1pm được tạo thành do viêc giảm điên áp từ 8 xuống 0V. ở giai đoạn này không cần kích động dung dịch. Điên cực được bao bởi một chất cách điên thuỷ tinh và đầu nhọn dược platini hoá để giảm điên trở của nó. Dòng điên được cung cấp bởi nguồn 15V mắc nối tiếp với một điên trở 1MQ, quá trình platin hoá yêu cầu thời gian dòng điên đi qua là 15- 30 giây.
Phương pháp dùng dòng xoay chiều để làm nhọn bằng điên đã được Gild phát triển (1964). Ông là người đã khắc axit các dây dẫn Platin- iridi (70%- 30%) dài 0,25mm để tạo ra các điên cực có đường kính đầu nhọn 1 pm. Guld đã đưa ra các số liêu quan trọng về kỹ thuật mà ông đã làm để nhận được đầu búp măng và đường kính đầu nhọn. Nói khái quát thì một điên cực được khắc axit bằng cách đưa dòng 12V vào dây platini- iridi và điên cực các bon (bề mặt 10cm2); dung dịch sử dụng ở đây là 100-500ml natri xyanua (8M), bổ sung thêm Natri hydroxit để đề phòng hình thành hydro xyanua. Cho dòng điên đi qua 3 phút, tốc độ rút ra sẽ quyết định dạng đầu búp măng. Đầu nhọn được hình thành bằng cách khắc axit tại điên áp 12V trong dung dịch natri xyanue chưa bão hòa và ngắt dòng điên khi đạt được 30% giá trị ban đầu của nó. Sau đó, điên cực được phủ một lớp thủy tinh dùng phương pháp Wollbarsh và đầu nhọn sẽ được tạo ra bằng quá trình platin hóa dùng dung dịch clorua platin 0,1%. Quá trình platin hoá được thực hiên bằng các dùng các xung dòng điên a10ms, điên cực được sử dụng làm cực âm của nguồn 8-15V. sau mỗi xung dòng điên, người ta đo trở kháng điên cực và quá trình được dừng lại khi đạt được “trở kháng mong muốn” (1-20MQ).
Có thể khắc axit bằng dòng xoay chiều là phương pháp không hiệu quả. Với dòng xoay chiều, về mặt lý thuyết, dòng chạy chiều này nối lại chiều kia, thì theo định luận điên phân của Farađay thì hiêu ứng mạng ở mỗi điên cực sẽ bằng không. Tuy nhiên, như ở cuối chương này sẽ chỉ ra, hoạt động của giao diên điên cực- chất điên phân với mật độ dòng điên lớn sẽ tạo ra kết quả tính chất dung dịch.

  1. Cách điên cho các vi điên cực kim loại

Không quan trọng vấn đề là điên cực kim loại có diên tích đầu nhọn nhỏ được sản xuất như thế nào, viêc cần thiết là phải phủ cách điên lên tất cả đầu nhọn. Gruest và các cộng sự (1950) chủ trương lấy kim ra từ trong hợp chất cách điên và làm khô đầu. Một điên cực được rút ra chầm chậm từ hỗn hợp cách điên và khi đầu nhọn hiên ra từ vật liêu cách điên, một giọt sẽ chảy từ phần búp măng của điên cực. lúc này đầu nhọn lại phải được nhúng nhanh và rút ra từ từ cho đến khi không cũn tạo ra giọt nữa. Sau đó, chất cách điên được kéo ở nhiêt độ phũng mà khụng cần nung.
Kỹ thuật đặt lớp cách điên thuỷ tinh trên điên cực nhỏ bằng kim loại đó được khám phá. Để tạo cách điên, cần đưa điên cực Platin- Iridi vào một giọt thuỷ tinh nóng chảy có hê số nở nhiêt giống như kim loại (8.5 x 10-6/ 0C). hạt sẽ hình thành do nhiệt trong phần tử platin-iridi có dạng chữ V được cấp năng lượng điên. Khi điên cực đi qua thủy tinh nung chảy, đầu điên cực cũng sẽ bị phủ một lớp thuỷ tinh mỏng. Điều này sẽ bị gián đoạn khi có dũng điên chạy qua nó trong quá trình platin hở. Sự xuất hiờn cỏc bọt tăm ở đầu nhọn chỉ ra rằng lớp thuỷ tinh mỏng đó bị loại bỏ.
Lớp thuỷ tinh phủ lên đầu điên cực đảm bảo tính cách điên rất bền, có độ rũ rỉ thấp. Tuy nhiên, việc sử dụng nó có kết quả yêu cầu thuỷ tinh được chọn cần có hê số nở nhiêt hoàn toàn như của điên cực kim loại. Nếu các hê số này khác nhau, thuỷ tinh sẽ bị gãy trong khi làm lạnh và độ cách điên sẽ không còn hoàn hảo.

  1. Các vi điên cực kim loại được kéo giãn bằng nhiêt.

Taylor (1925) nói rằng, một dây platin cỡ 35 đặt trong một ống mao dẫn thạch anh có thể kéo giãn bằng nhiêt trong một lò nung cực nhỏ để tạo ra điên cực platin cách điên bằng thuỷ tinh có đầu nhọn 1 μm. có lẽ, loại thạch anh được dùng có hê số’ nở nhiêt cũng giống như dây platin (8,99 x 10-6/ 0C), bởi vì Taylor đã không đề cập đến bất kỳ sự rò rỉ nào trong quá trình làm lạnh. Thật là thú vị, cũng trong cùng bài báo đó, ông nói đến viêc chỉ tạo một vi nam châm bằng cách kéo giãn bằng nhiêt một dây sắt (có hê số nhiêt 12.1 x 10-6 / 0C) trong một ống mao dẫn thạch anh. Do có các thành công với các kim loại có hê số nở nhiêt khác nhau, có thể thấy rằng nếu có sự khác biêt nhỏ về hê số nở nhiêt thì có thể bỏ qua.
Svactichin (1951) đã phát chế’ ra một loại vi điên cực kim loại chất lượng cao, nhưng giá thành thấp. ông là người đầu tiên đã nung chảy hợp kim bạc trong một ống thuỷ tinh Natri đường kính 1cm, sau đó kéo ống để nhận được lớp dẫn điên phủ thuỷ tinh dài, đường kính 5mm. Vì chất hàn bạc và thuỷ tinh nóng chảy ở cùng gần một nhiêt độ, cả hai có hê số nở nhiêt giống nhau, nên sẽ nhận được một cấu trúc ổn định về cơ khí và đổng nhấ’t về cách điên. Sau đó các đoạn kim loại được kéo giãn bằng nhiêt trong một lò cực nhỏ để tạo ra các điên cực có cách điên bằng thuỷ tinh với đường kính đầu nằm trong vùng 1-90 μm. Để giảm trở kháng của đầu nhọn kim loại, nó được mạ chất rôđi, sau đó phủ bằng platin đen. Khi các đường kính của đỉnh đầu đã có được, trở kháng của điên cực sẽ rất thấp.
Dowben và Rose (1953) đã đề cập đến sự khác nhau trong viêc tạo ra các điên cực mao dẫn được làm đầy kim loại. họ đã nấu chảy hỗn hợp gali (50%) và indi (50%) hoặc indi nguyên chất và các kim loại hấp thụ đã được nấu chảy (nhiêt độ nấu chảy tương ứng là 1100C & 1500C), nửa chừng hút vào ống thuỷ tinh chịu nhiêt có chiều dài 5 inch. ống này có hê số nở nhiêt 3.3 x 10-6/ 0C. hợp kim thấm vào ống thuỷ tinh sau đó được làm lạnh. ở 2mm phía đầu của hợp kim, ống thuỷ tinh được kéo dãn để tạo thành bình búp măng thuỷ tinh rỗng và đầu chóp của điên cực. Sau khi đầu chóp được hình thành, điên cực được nung nóng cho đến khi hợp kim chảy ra. tiếp theo, một kim khâu được cài vào ống và được dùng như một pitông để đẩy kim loại nóng chảy vào đầu cuối rỗng và làm lộ ra đầu chóp, sao cho có một hạt (đường kính ~30-50pm) được tạo thành phía ngoài đầu chóp. Khi điên cực làm lạnh, hạt được bỏ đi và đầu chóp kim loại phơi ra (đường kính được mạ vàng sau đó platin hoá).
Kỹ thuật hút nhiệt kim loại trong ống thạch anh hoặc ống thuỷ tinh rất dễ thực hiện và tạo ra các điện cực cách điện với các đầu chóp kim loại phoi bày có đường kính trong giới hạn 1 đến 90pm. việc áp dụng platin đen cho các điện cực như vậy đã giúp làm giảm trở kháng điện cực- chất điện phân. Đặc tính điện của loại điện cực này sẽ được nói đến ở phần sau.
Có hai yêu cầu cần được biết đến nếu dùng kỹ thuật này. Đó là việc dùng kim loại và chất cách điện có các điểm nóng chảy gần nhau và có các hệ số’ giãn nở nhiệt gần như nhau. Trừ các đầu đã trình bày, hầu như các nhà nghiên cứu đều không quan tâm đến dùng kim loại có hệ số nở nhiệt như nhau khi tiến hành phủ cách điện. Điều này dẫn tới khó khăn khi thực hiện làm lạnh điện cực. Thí dụ nguy co tạo ra các vết nứt cực nhỏ và sự gãy nứt bấ’t ngờ. tuy nhiên, các hỏng hóc như  vậy, ở mức độ nào đó, thường không xảy ra, nên trong thực tế sự không phù hợp của các hệ số nở nhiệt có thể bỏ qua.

  1. Vi ống chứa kim loại kết tủa bằng điện

Để khắc phục giá trị điện trở cao của vi ống chứa đầy chấ’t điện phân, Weale (1951) đã đề ra phưong pháp đổ đầy vi ống kim loại bạc được kết tủa bằng phưong pháp điện. Trước hết, một dây bạc mảnh dạng kim được đưa vào một vi ống thuỷ tinh rỗng. Dây bạc (đường kính 60pm) được làm nhọn bằng cách kéo nó cho đến khi bị gẫy. Sau đó, một mẩu dây platin được hàn ở phía đầu kia. Với dây bạc hình kim ở đầu chóp của vi ống, phía đầu lớn được bịt kín với dây platin bằng cách làm nóng chảy thuỷ tinh. Sau đó, điện cực được đặt vào nước tinh khiết đun sôi và không khí trong ống cực nhỏ bị đẩy ra khi nhiệt độ tăng lên. điện cực bị làm ngập nước và được làm lạnh để cho nước đi vào đầu mao dẫn và tạo mối tiếp xúc với dây bạc. sau đó, đầu chóp vi ống được làm đầy bạc bằng phưong pháp mạ điện dùng dung dịch bão hoà nitrat bạc. Dây platin (hàn nối dây bạc ở trong ống) được nối với cực âm của pin 12V nối tiếp với một chiết áp và một microampe kế. Đầu dưong của pin nối với điện cực bạc nằm trong dung dịch nitrat bạc. quá trình mạ được thực hiện với dòng điện 30mA trong 1/2 giờ, thời gian cần thiết để làm đầy đầu ống bởi kim loại bạc. Weale đã dùng một thiết bị tự động để xác định khi nào đạt được đầu nhọn, đó là sự giảm đột ngột của điện trở được đo liên tục trong quá trình mạ. Điều đó chỉ ra rằng đầu nhọn đã được làm đầy bởi kim loại bạc. Weale nói rằng, ông có khả năng làm cho các điện cực có đường kính đầu nhọn là 10μm và điện trở ở mức 1500Q. Các điện cực có đường kính nhỏ hon sẽ có điện trở cao hơn không cần thực hiện một xử lý phụ nào nữa.

  1. Các điện cực màng kim loại được làm lắng đọng bằng hơi

Hiện trên thị trường có hai kiểu điên cực nhỏ bằng kim loại được làm lắng đọng bằng hơi. Một kiểu đặc và kiểu kia rỗng giống như một vi ống nhỏ. Cả hai được chế tạo từ bộ đỡ bằng thuỷ tinh đường kính 0,75 hoặc 1mm. ở cả hai loại (đều gọi là vi điên cực), thuỷ tinh đều được phủ bằng một lớp mỏng platin dùng phương pháp lắng bằng hơi. Trên hình 9-52 là một vài kiểu xắp xếp hình học của loại điện cực này. Đầu chóp platin lộ ra phía trên của lớp cách điên là khoảng 1­-2μm, đường kính của đầu chóp nằm trong khoảng 1-20μm.
7.Kỹ thuật sản xuất mạch tích hợp
Một phương pháp khác chế’ tạo các điên cực có diên tích bề mặt nhỏ đã được Wise và Starr phát minh (1969). Hai ông đã áp dụng công nghê mạch tích hợp để chế tạo các điên cực đơn và bội từ một dải bằng vàng được liên kết với một màng mỏng điôxit silic trên một nền silíc (hình 9-53). Sau đó, vàng được phủ một lớp điôxit silic 0,4pm. lớp này được khắc axit để hình thành đầu ra nhỏ. Wise và Starr đã sản xuất các điên cực với các đầu chóp nhô ra có bề mặt 15 pm2. minh hoạ do các tác giả trình bày trên hình 9-53 chỉ rõ một mảng vạch các điên cực chắn giữ dưới 50pm. Mối liên hê điên dung với phần đỡ (đất) là 0,5pp/mm tính theo chiều dài điện cực.
Các điên cực mà Wise và Starr mô tả có ưu điểm là có thể giám sát chính xác các kích thước. Tuy nhiên, ở thời kỳ phát triển của hai ông, chúng chỉ được dùng ngoài tế’ bào hoặc đặt vào các tế’ bào có kích thước tương đối lớn. Tuy nhiên nữa sự cải thiên trong công nghê sẽ cho phép sản xuất các điên cực nhỏ hơn nhiều.
Bước kế tiếp trong việc sử dụng công nghê mạch tích hợp là sự hợp nhất trực tiếp bộ tiếp nguồn (hoặc bộ khuếch đại thuật toán) trên nền mang các điên cực kim loại. Bằng cách đó, các hiên tượng điên sinh học sẽ được ghép nối với một tầng đầu vào có trở kháng vào cao. Tín hiêu ra, nhận được từ trở kháng ra thấp của tầng đầu, sẽ có thể đưa tới thiết bị đo về thực tế sẽ không gặp nhiều khó khăn do tính điên dung của tải và nhiễu 60Hz.
8.Đo diên tích bề mặt của các vi điên tử kim loại
Với các phương pháp làm cách điên đã miêu tả trên đây, rất khó khăn để xác định kích thước của các đầu chóp để trần, vì lớp vật liêu cách điên thường rất mỏng ở đầu chóp làm cho viêc khảo sát bằng kính hiển vi khó thực hiên để phát hiên giới hạn của vùng cách điên. ở các trường hợp như vậy, diên tích đầu chóp thường được xác định bằng phương pháp mà Hubel (1957) đã khám phá. Sau đó, một giọt dung dịch muối trên bản kính được quan sát bằng kính hiển vi. Một dây nhỏ được đặt vào phần dung dịch đó và được nối với cực dương của pin, cực kia được nối với điên cực kim loại. Bề mặt hoạt động của điên cực có thể được đánh giá bằng viêc quan sát bề mặt, mà từ đó bong bóng khí hydrô thoát ra. Phương pháp này áp dụng rấ’t thuận lợi và được geddes, Baler (1966) và những người khác sử dụng để đo bề mặt của rất nhiều các điên cực kim nhỏ và lớn.